Поиск 
Наша рассылка на Subscribe.Ru
Энциклопедия Дисбактериоз



рассылка выходит
1 раз в неделю

Эволюция представлений о роли кишечной микрофлоры
Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека
Дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, теоретические и прикладные аспекты
Приказы Минздрава РФ
Методические рекомендации и пособия для врачей
Научные публикации
Рефераты научных публикаций
Изобретения
Энциклопедия Дисбак
Стимбифид - уникальное средство при дисбиозах

Пищевые волокна
Энергетическая ценность
Улучшение метаболизма липидов
Улучшение функции кишечника
Модифицирование кишечной микрофлоры – пребиотический эффект
Лечение и профилактика хронических заболеваний кишечника
Возможность использования при диабете
Профилактика рака
Иммунология
Увеличение минеральной адсорбции – профилактика остеопороза
Кишечная переносимость
Улучшение умственной деятельности и общего самочувствия
Список сокращений и терминов
Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов
главная »» Научные публикации

версия для печати версия для печати

Способность бактерий, входящих в состав пробиотиков, оказывать иммуностимулирующее воздействие, привлекает особое внимание исследователей [1, 2]. Это связано с широким применением биопрепаратов из живых микробных культур в клинической практике в качестве средств лечения острых кишечных инфекций и дисбактериозов различной этиологии. Одним из важнейших показателей неспецифической резистентности макроорганизма является уровень функциональной активности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы, поскольку они первыми взаимодействуют с чужеродными антигенами при развитии инфекции и играют существенную роль в противомикробной защите организма.

Установлено, что бактерии - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (лактобактерии, бифидобактерии и энтерококки) при парентеральном введении оказывают стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов лабораторных животных [3, 4].

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus, которые в последнее время все чаще используются для разработки новых пробиотиков [5, 6], в этом плане изучены недостаточно.

В частности, не исследована динамика активации макрофагов после однократного введения бацилл, зависимость уровня стимуляции от введенной дозы препарата, а также от штаммовых особенностей культур, составляющих основу различных пробиотиков.

Поэтому целью настоящей работы явилось изучение влияния новых биопрепаратов из бактерий рода Bacillus - биоспорина и субалина - на активность перитонеальных макрофагов мышей.

Материал и методы

В опытах использовали новые пробиотики - биоспорин (серия 030294) производства ОАО "Днепрофарм" и субалин (серия 2) Института микробиологии и вирусологии НАН Украины. В состав биоспорина входят 2 культуры аэробных спорообразующих бактерий: Bacillus subtilis ВКПМ-В 2335 и B.licheniformis ВКПМ-В 2336; основой субалина является штамм Bacillus subtilis ВКПМ-В 4759, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном интерферона $\alpha$-2 человека.

Исследования проводили на самцах мышей линии СВА массой 18-20 г. Каждая группа состояла из 10 животных. Пробиотики вводили животным однократно перорально или внутрибрюшинно в дозах 106 и 109 микробных клеток/мышь. Инактивированные препараты получали кипячением суспензии живых клеток в течение 30 минут.

Животных забивали путем цервикальной дислокации. Макрофаги перитонеального экссудата получали методом [7], используя для лаважирования брюшной полости среду N 199. Жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с трипановым синим, составляла 95-98%.

Функциональную активность макрофагов определяли методом люминолзависимой хемилюминесценции [8], применяя для стимуляции опсонизированный стафилококк. Клетки Staphylococcus aureus 209P инактивировали прогреванием при 70њС в течение 5 мин, затем опсонизировали 5% свежей аутологичной сывороткой в течение 30 мин при 37њС. Макрофаги перитонеального экссудата получали суммарно от интактных мышей (контроль) и от групп мышей через различные сроки после введения им биопрепаратов (в опытах при пероральном введении пробиотиков), либо только от интактных животных (при исследовании влияния биопрепаратов на фагоцитарную активность макрофагов в опытах in vitro). Фагоциты суспендировали в среде N 199 с добавлением 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота до концентрации 2,0x106 клеток в 1 мл, вносили 1 мл такой суспензии в кварцевые флаконы и инкубировали 1,5 часа при 37њС. Монослой отмывали средой N 199 от неприкрепившихся клеток, добавляли 1 мл раствора Хенкса, промывали и добавляли раствор люминола (приготовленный на 0,005 М фосфатном буфере, рН 7,2) в конечной концентрации 10-5 М и 1 мл 1 млрд. суспензии опсонизированного стафилококка.

Интенсивность хемилюминесценции изучаемых образцов регистрировали в течение 90 мин с 15-минутными интервалами в $\beta$-счетчике (КПО "Медаппаратура", Киев) с отключенной схемой согласования импульсов. Каждую пробу дублировали тремя повторностями. Вычисляли индекс стимуляции (ИС) по формуле:

ИС = (O - K) / К,

где O - число импульсов в системе макрофагов, полученных от животных, которым вводили пробиотики; K - число импульсов в системе макрофагов, полученных от интактных животных.

Для изучения влияния пробиотиков на длительность персистенции S.aureus в почках мышей исследуемые биопрепараты вводили животным перорально в дозе 106 и 109 микробных клеток/мышь за 4 часа до внутрибрюшинного заражения животных S.aureus 209 в дозе 1 ЛД50, а также через 12 и 24 часа после заражения. Через различные сроки после окончания введения пробиотиков проводили бактериологические исследования почек опытных и контрольных животных, последних заражали S.aureus 209Р без предварительного применения биопрепаратов. Почки извлекали асептически и растирали в ступке со стерильным кварцевым песком. Готовили последовательные разведения полученных гомогенатов в стерильном физиологическом растворе. Различные разведения гомогената высевали на чашки Петри с 1% глюкозным агаром. Посевы инкубировали в термостате при 37њС и через 18 часов подсчитывали количество выросших колоний стафилококка. Полученные данные пересчитывали на 1 г гомогената. Экспериментальные данные обрабатывали статистически [9].

Результаты и обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что как внутрибрюшинное, так и пероральное введение пробиотиков из бацилл оказывает стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата (рис. 1). Уже через 1 час после введения биопрепаратов регистрируется увеличение функциональной активности перитонеальных макрофагов. Уровень этой стимуляции различен для разных пробиотиков и зависит от дозы и способа введения препарата. Наиболее высокие значения индекса стимуляции (ИС) отмечены при внутрибрюшинном введении субалина в дозе 109 микробных клеток.

Рис. 1. Функциональная активность перитонеальных макрофагов мышей после введения пробиотиков.
1 - введение per os, 2 - внутрибрюшинное введение.

Биоспорин и субалин предназначены для профилактики и лечения острых кишечных инфекций и дисбактериозов различной этиологии, поэтому особый интерес представляют данные об изменении функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата при пероральном применении этих пробиотиков. Установлено, что при однократном пероральном введении изучаемых биопрепаратов наблюдается постепенная активация макрофагов с максимумом через 4 часа. Так же, как и при внутрибрюшинном введении, отмечается зависимость уровня стимуляции макрофагов от количества перорально введенных микробных клеток - наибольшие значения ИС зарегистрированы при применении пробиотиков в дозе 109 микробных клеток. Хотя закономерности стимуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов одинаковы для биоспорина и субалина, наибольшая эффективность отмечена при применении субалина. Так, максимальный ИС при введении субалина составил 29,0 3,4, для биоспорина - 7,47 1,03 (рис. 2). Через 24 часа функциональная активность макрофагов постепенно снижается, однако все же остается более высокой, чем у интактных животных.

Рис. 2. Динамика изменения функциональной активности перитонеальных макрофагов после однократного перорального введения пробиотиков.
1 - биоспорин в дозе 106 микр. кл., 2 - биоспорин 109 микр. кл., 3 - субалин в дозе 106 микр. кл., 4 - субалин 109 микр. кл.

Данные, полученные в опытах на животных, подтверждаются экспериментами in vitro. При инкубации перитонеальных макрофагов интактных животных с пробиотиками наибольшие значения ИС зарегистрированы для субалина. Инактивированные бактериальные клетки оказывали менее выраженный эффект стимуляции макрофагов (рис. 3).

Рис. 3. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность перитонеальных макрофагов в опытах in vitro.
1 - живые клетки, 2 - инактивированные клетки.

Таким образом, биоспорин и субалин существенно повышают функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата как в опытах in vitro, так и in vivo.

Стимулирующее воздействие биопрепаратов из живых микробных культур на активность клеток перитонеального экссудата отмечалось и другими исследователями, но при парентеральном введении [10, 11]. Показано также, что некоторые лактобактерии при пероральном применении вызывают активацию перитонеальных макрофагов [11, 12]. Однако одни авторы не смогли объяснить полученные результаты [13], другие считают, что продукты метаболизма и компоненты клеточных стенок, всасываясь в кишечнике, стимулируют клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы [12].

Подобные исследования не проводились с пробиотиками из аэробных спорообразующих бактерий, поэтому для объяснения полученных данных проведены дополнительные эксперименты. Ранее нами [14], а также другими исследователями [15] было установлено, что при пероральном введении живых микробных культур часть из них (0,01%) в первые же минуты проникает в кровь и органы экспериментальных животных. В дальнейшем непатогенные микроорганизмы (в частности, бациллы, лактобациллы) очень быстро элиминируются из внутренней среды макроорганизма и через 18 часов уже не выявляются при бактериологических исследованиях. Исходя из этого нами проведено сравнительное изучение уровня стимуляции перитонеальных макрофагов и количества бацилл, составляющих основу биоспорина, регистрируемых во внутренних органах мышей, при однократном пероральном введении пробиотика.

Установлено, что элиминация бактерий, входящих в состав биоспорина, из внутренней среды организма сопровождается увеличением функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата (рис. 4). Максимальное значение ИС макрофагов отмечено при значительном (на 2 порядка) снижении количества жизнеспособных бацилл во внутренних органах животных.

Рис. 4. Взаимосвязь между уровнем функциональной активности перитонеальных макрофагов и количеством клеток биоспорина во внутренней среде макроорганизма.
1 - функциональная активность, 2 - количество жизнеспособных клеток.

Установленные факты давали основание предположить, что пероральное введение пробиотиков из бацилл может существенно влиять на протекание инфекционного процесса вне желудочно-кишечного тракта. На модели пиелонефрита у мышей показано, что применение биоспорина способствует более быстрой элиминации S.aureus из почек животных. Этот процесс зависит от дозы препарата: при пероральном введении биоспорина в дозе 109 микробных клеток полное исчезновение стафилококка регистрируется через 36 часов после его внутрибрюшинного введения, а при дозе 106 микробных клеток - через 48 часов. В почках контрольных животных количество стафилококка через 48 часов составляло 6,6 lg КОЕ/г.

Проведенные исследования показали стимулирующий эффект биоспорина и субалина на клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы как при внутрибрюшинном, так и при пероральном введении животным. Полученные данные о стимуляции неспецифической резистентности макроорганизма при пероральном применении пробиотиков из бацилл убедительно свидетельствуют о том, что эти биопрепараты перспективны не только для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, но, возможно, и для лечения бактериальных инфекций, локализованных вне желудочно-кишечного тракта. О потенциальной возможности использования пробиотиков для таких целей свидетельствуют данные и других исследователей [3, 16].

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N2, стр. 20-23.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дрозд Т.Е., Кременчуцкий Г.Н., Горбунова М.Л. Журн микробиол 1994; 6: 111.

2. Исаева Н.П., Шахмарданов М.З., Земскова Л.Н. и др. Там же 107-108.

3. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66: 5: 365-378.

4. Kitazawa H., Nomura M., Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74: 7: 2082 - 2088.

5. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Дисбактериозы и эубиотики: Тез докл Всерос научн-практ конф. М 1996; 26.

6. Подберезный В.В., Париков В.А. Матер Всерос научн и учеб-метод конф по акушерству, гинекол и биотехн размножения животных. Воронеж 1994; 253-254.

7. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М 1978; 175.

8. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.Итоги науки и техники: Биофизика 1989; 24: 172.

9. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л 1962; 290.

10. Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А., Осадчая А.И. и др. Микробиол журн 1996; 2: 46-55.

11. Kato I., Yokokura T., Mutai M. Microbiol Immunol 1983; 27: 7: 611-614.

12. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции: Дис ... д-ра мед наук. М 1994; 53.

13. Perdigon G., Macias M.E.N., Alvarez S. et al. Infect Immun 1986; 53: 2: 404-410.

14. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Микробиол журн 1988; 6: 56-59.

15. Berg R.D. Trends Microbiol 1995; 4: 149-154.

16. Смеянов В.В., Мальцева Н.Н. и др. Журн микробиол 1992; 11-12: 12-15.

наверх
АНОНСЫ
Санкт-Петербург. Медико-консультативный центр профессора Луфта В.М.

Дисбактериоз кишечника. Какую микрофлору будем защищать и восстанавливать – свою или чужую?

Ведущими учеными-гастроэнтерологами Учебно-научного Медицинского Центра Управления делами Президента РФ рекомендован Стимбифид с целью стимуляции роста облигатной флоры (в частности Бифидобактерий) у практически здоровых лиц, а также для профилактики и восстановления нарушений микробиоценоза, связанного с проведением антибактериальной терапии

Учеными выявлена высокая клиническая эффективность Стимбифида при острых кишечных инфекциях у детей

Ученые установили, что новейшая Российская разработка на основе фруктоолигосахаридов – Стимбифид увеличивает содержание полезных бифидобактерий в кишечнике до 10 миллиардов (!) в 1г, что превышает аналогичные показатели при использовании традиционного бифидумбактерина в 10 раз!

Стимбифид
rpatron@mail.ru
При копировании материалов с сайта гиперссылка обязательна: disbak.ru
Партнеры: gastroportal.ru - Гастроэнтерологический портал России
rekicen.ru - Лучшая биодобавка России

speleomed.ru - Российский спелеомедицинский портал
Rambler's Top100 Яндекс цитирования